武汉友名生物公司(多图)-腺病毒载体系统

基因导入细胞常用方法

转染

　 重组的噬菌体DNA也可象质粒DNA的方式进入宿主菌，即宿主菌先经过CaCl2，电穿孔等处理成感受态细菌再接受DNA，进入感受态细菌的噬菌体DNA可以同样copy和繁殖，这种方式称为转染（transfection）。M13噬菌体DNA导入大肠杆1菌就常用转染的方法。重组DNA进入宿主细胞也常用转染方式。zui经典的是1973年建立的磷酸钙法，其利用的基本现象是：DNA如以磷酸钙-DNA共沉淀物形式出现时，培养细胞摄取DNA的效率会显著提高。用电穿孔法处理培养的哺乳类细胞也能提高细胞摄取DNA能力，腺病毒载体系统，但所用外加电场的强度、电脉冲的长度等条件与处理细菌者都很不相同。用人工脂质膜包裹DNA，形成的脂质体可以通过与细胞膜融合而将DNA导入细胞，方法简单而有效，但缺点是有细胞毒性和血1清的不亲和性，近年来人们发现了一种更为有效的转染试剂－阳离子聚合物，其克服了脂质体转染试剂细胞毒性大，在体内易被血1清清除等缺点，具有转染效率1高，操作简单而日益受到重视。

科学家在培养转0基因植物时，常用什么中的质粒作为载体？

（1）具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克1隆载体的分子大小建议不要超过10Kb。pBR质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA部分片段；

（2）具有两种抗1菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。当我们把一个DNA部分片段插入到某一个标记基因内时，该基因就失去了相应的功能。当把这种重组DNA分子转到宿主细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。很显然，既要指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又要指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA部分片段，那么这种载体必须至少具有两个标记基因。另外，pBR质粒载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉1素扩增之后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

电1击法

　　电1击法基本原理是电脉冲使细胞膜产生可逆性的“微孔”，外源DNA可通过这些微孔进入受体细胞原生质体内。

　　1985年Fromm等用electric shock法将pat基因导入了玉米原生质体，得到了该基因稳定表达的愈伤组织。随着玉米原生质体再生技术的研究取得进展，1988年Rhodes等用electric shock法转化玉米原生质体，初步获得了完整的转0基因植株。electric shock法还可以对幼胚、愈伤组织和胚性悬浮细胞系进行遗传转化。1992年D’Hallum K等以玉米幼胚和愈伤组织为受体，用electric shock法导入neo基因，获得了可育的转0基因植株，并且neo基因能稳定地遗传给后代。1993年Sukhapinda等用electric shock法转化从玉米花粉愈伤组织分离的原生质体，将gusA和nptⅡ转入原生质体，获得单倍体转化植株。1994年Laursen等以果胶降解酶处理悬浮细胞系后，通过electric shock法导入bar基因，也获得了可育的转0基因玉米。

　　电1击法操作简单，不受宿主限制，在遗传转化技术研究的初期得到了较为广泛的应用，但是它的转化效率较低，而且对有壁细胞或组织的转化效果较差。