就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，荧光原位杂交，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。
Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。
在条件都得到满足的情况下，杂交的成败就取决于保温时间。时间短了，杂交反应不完成；时间长了也无益，会引起非特异结合增多。一般杂交反应要进行20h左右。1966年Britten和Kohne推荐用Cot =值来计算杂交反应时间。Cot 值实际上是杂交液中单链起始浓度（Co）和 反应时间（t）的乘积。实验表明Cot =100时，杂交反应基本完成。Cot=0，基本上没有杂交。例如在液相杂交中未标记的DNA 400μg/ml（按单股DNA每微克 紫外吸收值为0.024计算，总的吸收值为 9.6），如果反应时间为21h，那么对于未标记的DNA来说，Cot =9.6/21 =100.8，杂交完成了。对标记DN A（浓度为0.1μg/ml）来说Cot值为0.05，这就充分排除了标记DNA的自我复性。Tm值25℃时杂交***佳，所以首先要根据公式（4）计算杂交体Tm 值。由此式可见，通过调节盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。
原位杂交试验
收集斑马鱼的胚胎，在Holfretor水中培养，到达所需要的发育时期时，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小时后用50%甲6醇2%多聚甲醛溶液洗，然后换成甲9醇，在-20C 保存，待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧6水处理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培养，可阻断色素的形成)
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