核酸共沉剂-友名生物技术(图)

植物ＤＮＡ的ＳＤＳ提取法：1 取2-3ｇ新鲜叶片，在液氮中研磨成粉状(防止溶化)后转入15ｍｌ离心管中。2 加入5ｍｌ于65℃预热的提取缓冲液，65℃水浴保温30ｍｉｎ(摇动数次)，核酸共沉剂，使提取液与样品充分混合。3 加入2ｍｌ5ｍｏｌ/ＬＫＡｃ，剧烈振荡，冰浴保温20ｍｉｎ以上。4 2700×ｇ离心20ｍｉｎ，将上清液倒入新的15ｍｌ离心管中，(若提取ＤＮＡ用于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等实验，一般在转移上清时加滤膜，防止样品残渣混入，可保证ＤＮＡ纯度)。5 加入4ｍｌ氯1仿/异戊1醇(24∶1)，摇匀，平衡，2700×ｇ离心15ｍｉｎ。6 在另一新的15ｍｌ离心管中加入5ｍｌ预冷的异丙1醇，将上清液用移液转入此管，在-20℃冷却30ｍｉｎ以上。7 2700×ｇ离心10ｍｉｎ，弃去上清液，用4ｍｌ70%乙醇洗涤，室温保持10ｍｉｎ。2700×ｇ离心3ｍｉｎ，倒去上清液。8 重复步骤7，用4ｍｌ70%乙醇洗涤，室温保持10ｍｉｎ。2700×ｇ离心3ｍｉｎ，倒去上清液。超净工作台内吹干(3ｈ左右)。9 加1ｍｌＴＥ缓冲液中溶解，加10μｌＲＮａｓｅ(10ｍｇ/ｍｌ)，在37℃恒温箱中温育20ｍｉｎ。10 再加100μｌ3ｍｏｌ/ＬＮａＡｃ和2ｍｌ无水乙醇，2700×ｇ离心3ｍｉｎ，倒去上清液。超净工作台内吹干(3ｈ左右)。11 将ＤＮＡ沉淀溶于150μｌＴＥ中，置于超净工作台内(3ｈ左右)。将ＴＥ溶液转入已灭菌的1 5ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，-20℃保存备用。

棉花等酚类、多糖类物质较多的植物ＤＮＡ提取法：

1 取2ｇ新鲜幼嫩的叶片放入研钵中，加入液氮后快速、充分研磨，待成极细的粉末状时迅速转入到50ｍｌ离心管中。

2 在50ｍｌ离心管中加入10ｍｌ冰预冷的提取缓冲液，在涡悬振荡器上充分混匀。

3 于4℃，2700×ｇ离心20分钟，倒去上清液。

4 在沉淀中加入5ｍｌ裂解缓冲液，在涡旋振荡器上充分混匀。

5 于65℃水浴锅中温育30ｍｉｎ。

6 加入5ｍｌ氯1仿/异戊1醇(24/1)，并上下翻转以充分混合。

7 于4℃，2700×ｇ离心5分钟。

8 转移上层水相至一新的50ｍｌ离心管中。

9 重复步骤7-9一次。

10 加入2/3体积的冰预冷的异丙1醇，并上下翻转以充分混合，至-20℃2ｈ。

11 于4℃，1200×ｇ离心10ｍｉｎ。

12 在一新管中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液，用玻棒将ＤＮＡ转入该管(如不能直接用玻棒缠出，可离心后倒出上清，再在其中加入20ｍｌ含80%乙醇15ｍｍｏｌ/ＬＮａＡｃ溶液)，放置20ｍｉｎ后稍许离心，移走上清并吸出残存乙醇，室温干燥。

13 加入1 0ｍｌＴＥ(10ｍｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ-ＨＣｌＰＨ=8 0，1ｍｍｏｌ/ＬＥＤＴＡ)并加入终浓度为20(ｇ/Ｌ的ＲＮａｓｅＡ，过夜。

14 风干，用50μｌＴＥ缓冲液溶解，存于-20℃备用。

1.人ELISA***盒在测定时，受检标本（测定其中的antibody或抗原）与固相载体表面的抗原或antibody起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原antibody复合物与液体中的其他物质分开。　　

2.再加入酶标记的抗原或antibody，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。　　

3.加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。　　

4.由于酶的催化效率很高，间接地放大了免1疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定antibody。　　

5.然而，影响Elisa试验结果的因素很多，故加强各个环节的才能充分发挥其方法学的优点。