粗提物定量PCR***-友名生物

PCR的创建

Khorana (1971)等***早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA***。”但由于当时***序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上分子克1隆技术的出现提供了一种克1隆和扩增***的途径，所以Khorana的设想被人们遗忘了。

1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上，猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第yi个PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。

1985年10月25日申请了PCR的专1利，

1987年7月28日批准（专1利号4，683，202 ），Mullis是第yi个发明人；

1985年12月20日在Science杂志上发表了第yi篇PCR的学术论1文，粗提物定量PCR***，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。

梯度PCR仪

把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（温度梯度），通常12钟温度梯度，这样的仪器就叫梯度PCR仪。

工作模式和原理同普通PCR仪一样，它出了又普通PCR仪的功能外还多了一个梯度退火功能。DNA部分片段的扩增对温度的控制精度要求特别高，不同的DNA部分片段其退火温度不一样，通过计算DNA部分片段中的CG碱基的含量只能初步的判断出***优退火温度在+5℃范围内，如果用普通PCR仪进行研究，需重复扩增很多次，然后做电泳进行分析来确定***优退火温度。而梯度PCR仪则只需要一次就可以完成，在节省了时间的同时提高了实验的可靠性和准确性。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样节约成本的同时也节约了时间和经费。在不设置梯度的情况下，梯度PCR仪也可以做普通PCR扩增。

该仪器主要应用于科研，教学机构，***临床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。

不对称PCR(asymmetric PCR）枝术

两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR.在扩增循环中引入不同的引物浓度.常用50~ 100+1比例。在起初的10~ 15个循环中主要产物还是双链DNA.但当低浓度引物被消耗尽后。高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA.

应用:可制备单链DNA部分片段用于序列分析或核酸杂交的探针。

反转录PCR(reverse transcription， RT- PCR技术

当扩增模板为RNA时。需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RT - PCR应用非常广泛。无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。

修饰引物PCR技术

为达到某些特殊应用目的.如定向克1隆、定1点突变、体外转录及序列分析等。可在引物的5*-端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。