





PCR反应特点
灵敏度高:PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在***学中***小检出率为3个***。
简便、快速:PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应,一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放1射性污染、易推广。
纯度要求低:不需要分离病毒或***及培养细胞,DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活***等DNA扩增检测。
污染的监测
一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
1、阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR***经自己使用稳定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照。
2、阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照。它包括:
(1)标本对照:被检的标本是血1清就用鉴定后的正常血1清作对照;被检的标本是***细胞就用相应的***细胞作对照。
(2)***对照:在PCR***中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测***是否污染。
3、重复性试验。
4、选择不同区域的引物进行PCR扩增。
梯度PCR仪
把一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常12钟温度梯度,这样的仪器就叫梯度PCR仪。
工作模式和原理同普通PCR仪一样,它出了又普通PCR仪的功能外还多了一个梯度退火功能。DNA部分片段的扩增对温度的控制精度要求特别高,不同的DNA部分片段其退火温度不一样,通过计算DNA部分片段中的CG碱基的含量只能初步的判断出***优退火温度在+5℃范围内,如果用普通PCR仪进行研究,需重复扩增很多次,然后做电泳进行分析来确定***优退火温度。而梯度PCR仪则只需要一次就可以完成,在节省了时间的同时提高了实验的可靠性和准确性。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样节约成本的同时也节约了时间和经费。在不设置梯度的情况下,梯度PCR仪也可以做普通PCR扩增。
该仪器主要应用于科研,高GC缓冲液,教学机构,***临床研究,高等院校,病毒分析,疾控中心等。
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