快切酶-友名生物(在线咨询)

限制性酶切分析法

限制性酶切分析法是指***组或一段核酸用限制性内切酶消化产生的片段经电泳等方法分离形成特别的条带图谱，对DNA序列的特征进行的分析。限制性酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的***并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用。

限制酶是***工程中所用的重要切割工具。科学家已从原核生物中分离出了许多种限制酶，并且已经商品化，在***工程中广泛使用。根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无特异性的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的DNA序列上进行切割。

DNA部分片段的连接

　　DNA部分片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接( 5′末端浓度为0.1-1.0 μM)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3′和 5′末端都保留完整，连接反应才会发生;而且只有那些识别位点完全***的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3′和 5′末端都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。

　　限制性内切酶对环状质粒DNA产生的酶切片段数与切口数一致。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切口的数目;从片段迁移率可判断酶切片段大小。用已知分子量的线状DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子大小。

　　质粒DNA的相对分子量(Mr )一般在106～107 范围内，快切酶，如质粒pBR的相对分子质量为2.8×106 ，在细胞内有三种构型：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在;②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA;③双链线状DNA由于两条链的切口在同一部位被切断，不能成环，完全开放成线状，简称线性DNA。如果要测定质粒DNA的相对分子量，建议把质粒用单一切口的酶水解得到线性DNA部分片段。三种构型的质粒DNA 在电泳时的泳动速度为：共价闭环DNA>线状DNA >开环DNA。