限制性内切酶已有百余种，每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性，酶的活性需Mg+2来激1活。不同的酶也有许多差别：有些酶除需Mg+2外，还需ATP 等其他辅助因子的激1活;切割位点和识别序列间的距离不同;有的内切酶同时具有甲1基化作用。根据这些差别，可将限制性内切酶分为I、II 和III 种类型。II 型限制性内切酶只需要二价镁离子的激1活，酶在其识别序列内切割双链DNA，产生的各种DNA部分片段具有相同的末端结构，而且大多数的II 型酶可提供粘性未端，有利于片段再连接，大部分II 型酶所识别的序列具有反向对称的结构，或称之回文结构。如EcoRI 和HindIII 的识别和切口分别为：
EcoRI ： G ↓AATT C HindIII ： A↓AGCT T
T TCGA↑ A C TTAA↑G
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。它可分为三类：
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲1基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割某一特异的核苷酸序列； 另一种为***的甲1基化酶，它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克1隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列：5"- G↓AATTC-3"），有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA部分片段（如***aⅠ：5"-CCC↓GGG-3"）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA部分片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
蓝白斑筛选鉴定
用于克1隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ***中单一的酶切位点，连接，内切酶，转化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克1隆后***是完整的，一个完整的***产生蓝斑，一个不完整的***(例如，降解的DNA末端)产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3%。
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