GC Buffer-友名生物(在线咨询)

PCR反应特点

灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶1细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在***学中***小检出率为3个***。

简便、快速：PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放1射性污染、易推广。

纯度要求低：不需要分离病毒或***及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活***等DNA扩增检测。

PCR出现假阴性

不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及Br乙锭的使用， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶***1剂，③模板中蛋白质没有消化除净，GC Buffer，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。

巢式PCR(NEST PCR枝术.

先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量.然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带。此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少 巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些，且用量较少。同时在第yi次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度。这样在第yi次PCR时，由于较高退火温度下内引物不能与模板结合，故只有外引物扩增产物，经过若干次循环。待外引物基本消耗尽，无需取出第yi次PCR产物，只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤。同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR( drop-in， drop-out PCR)上述三种方法主要用于少量DNA模板的扩增。