内切酶-友名生物技术(图)

几种酶的比较及限制酶

1几种酶的比较

(1)限制性内切酶:作用于DNA分子，切割磷酸二酯键，形成黏性末端或平末端。

(2) DNA连接酶:作用于DNA分子片段，连接磷酸二酯键，形成重组DNA分子。

(3) DNA聚合酶:作用于脱氧核苷酸，连接磷酸二酯键，形成新的DNA分子。

(4)解旋酶:作用于DNA分子，作用于氢键，形成DNA分子的单链。

2.限制酶:

(1)一种限制酶通常只识别一种特定的碱基序列，但是有少数限制酶却可以识别不止

一种碱基序列。

(2)不同限制酶也可以识别同-碱基序列;

(3)不同限制酶识别的碱基序列虽然不同，但切出的末端也可能相互连接。

蓝白斑筛选鉴定

　　用于克1隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ***中单一的酶切位点，连接，转化，内切酶，并涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克1隆后***是完整的，一个完整的***产生蓝斑，一个不完整的***(例如，降解的DNA末端)产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3%。

酶切图谱

图谱介绍：DNA限制性内切酶酶切图谱，又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、***组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、***文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP（限制性的片段长度多态性）技术更是建立在它的基础上。

构建方法：构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性的片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和准确程度。

制作过程：在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应***适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和***适反应温度（大多数为37℃）。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。