反转录引物-友名生物(在线咨询)

T4 RNA连接酶

用途：用RNA 3"末端标记；RNA和RNA分子间连接；寡核苷酸的环化；tRNA修饰；5" RACE中寡核苷酸连接到cDNA单链；在蛋白质特***点引入非天然氨基酸。

来源：由大肠杆1菌表达，表达***的来源为T4嗜菌体。

活性定义：37℃30分钟内，催化1 nmol 5"-[P]-(A)12-18成为磷酸酶不能消化的环形产物所需的酶量定义为1个活性单位。

活性检测条件：50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，10μM 5"-[P]-(A)12-18(10μM in 5"-termini)。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷1酸酯酶。

酶储存溶液：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM DTT，50mM KCl，0.1mM EDTA，50%(v/v)glycerol。

Reaction Buffer(10X)：500mM HEPES-NaOH(pH8.0 at 25℃)，100mM MgCl2，100mM DTT。

自身引导法 。合成的单链eDNA3’端能够形成一短的发夹结构，这就为第二链的合成提供了现成的引物。当链合成反应产物的DNA—RNA杂交链变性后利用大肠DNA聚合酶I Klenow片段或反转录酶合成eDNA第二链，用对单链特异性的S1核酸酶消化该环，即可进一步。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5’端序列出现缺失和重排，因而该方法很少使用。

DNA copy的引发

所有DNA的 copy都是从固定起始点开始的，而目前已知的DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链，反转录引物，而不能从头合成DNA链，那么一个新DNA的 copy是怎样开始的呢？研究发现，DNA copy时，往往先由引发酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物 3"端开始合成新的DNA链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链来说，引发过程就十分复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还牵涉冈崎片段的形成和连接。