WB化学发光底物-友名生物技术

蛋白表达系统

蛋白表达系统是指由宿主、外源***、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源***在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成：

1、宿主。表达蛋白的生物体。可以为***、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。

2、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，WB化学发光底物，分为原核（***）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源***片段。通过载体介导，外源***可以在宿主中表达。

3、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫-杆状病毒表达体系中的杆状病毒。

微量凯氏（kjeldahl）定氮法

样品与浓1***共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与***作用，变成***氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：

NH2 CH2 COOH+3H2 SO4 ――2CO2 +3SO2 +4H2O+NH3 (1)

2NH3 +H2 SO4 ――(NH4 )2 SO4 (2)

(NH4 )2 SO4 +2NaOH――2H2 O+Na2 SO4 +2NH3 (3)

反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。

无细胞系统是利用细胞提取物（而不是细胞）进行***转录和翻译的系统。一个无细胞***表达系统主要包括三个部分：细胞提取物，反应混合液，以及核酸模板

1.细胞提取物：从细胞中提取的物质，主要包含核糖体、RNA聚合酶、其他转录和翻译蛋白（比如σ因子、起始因子和延伸因子），以及用于能量代谢的酶和辅因子。在有些菌株的提取物中，可能***了蛋白酶和核酸酶的活性。

2.反应混合液：包含蛋白质合成所需的一些原料，如氨基酸、核苷酸、盐离子（如铵盐、镁、钾）、能源（糖类、磷酸肌酸等）、拥挤***（crowding agents）、代谢辅因子（辅酶A、NAD）、缓冲液、tRNA以及其他代谢添加剂等。

3.核酸模板：可以是质粒DNA或PCR产物线装DNA，浓度通常在1-20 nM。

无细胞系统一般的反应体积为10微升，但是根据其实际应用，反应体系可以从10^(-15)到10^3变化。在开始反应时，将三种组分在16-37℃下孵育，蛋白质合成将在1-24h内进行。