





DNA copy的引发
所有DNA的 copy都是从固定起始点开始的,而目前已知的DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链,而不能从头合成DNA链,那么一个新DNA的 copy是怎样开始的呢?研究发现,DNA copy时,往往先由引发酶在DNA模板上合成一段RNA引物,再由DNA聚合酶从RNA引物 3"端开始合成新的DNA链。对于前导链来说,这一引发过程比较简单,只要有一段RNA引物,DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链来说,引发过程就十分复杂,需要多种蛋白质和酶的协同作用,AMV反转录酶,还牵涉冈崎片段的形成和连接。

以Riboclone M-MLV CDNA合成技术为例。Riboclone M—MLV cDNA合成系统采用M—MLV反转录酶的RNase H缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。该系统的链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶I进行置换合成,用T4 DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。

T4 RNA连接酶
用途:用RNA 3"末端标记;RNA和RNA分子间连接;寡核苷酸的环化;tRNA修饰;5" RACE中寡核苷酸连接到cDNA单链;在蛋白质特***点引入非天然氨基酸。
来源:由大肠杆1菌表达,表达***的来源为T4嗜菌体。
活性定义:37℃30分钟内,催化1 nmol 5"-[P]-(A)12-18成为磷酸酶不能消化的环形产物所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件:50mM Tris-HCl(pH7.5),10mM MgCl2,10mM DTT,1mM ATP,10μM 5"-[P]-(A)12-18(10μM in 5"-termini)。
纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶,不含磷1酸酯酶。
酶储存溶液:10mM Tris-HCl(pH7.5),1mM DTT,50mM KCl,0.1mM EDTA,50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X):500mM HEPES-NaOH(pH8.0 at 25℃),100mM MgCl2,100mM DTT。
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