错位切割含目的基因的DNA部分片段和运载体一形成黏性末端
单酶切：同一种限制酶分别切割含目的基因DNA部分片段与运载体。这是较简单的一种方法，含目的基因的DNA部分片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。
用同裂酶去切割含目的基因DNA部分片段与运载体。有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶(同切酶或异源同工酶)。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
核酸酶污染的过夜鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 底物DNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的dna酶。可以温育过夜的zui大酶单位数。
核酸外切酶污染鉴定
所有的限制性内切酶与1μg 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA在50μl反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。
限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，内切酶，可将限制酶分为三种类型，分别是型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的化，又催化非化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
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