反转录预混液-友名生物技术(图)

 PCR反应五要素

参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA部分片段，细胞内DNA复1制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)。

[PCR步骤]标准的PCR过程分为三步:

1.DNA变性(90°C-96*C): 双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火(25C-65"C): 系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性***佳)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5"端→3"端延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是***佳也能在很短的时间内copy完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60°C -65C间进行，以减少一次升降温过程，提

高了反应速度。

PCR循环参数

预变性模板DNA完全变性与PCR酶的完全激1活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考***说明书，一般未修饰的Taq酶激1活时间为两分钟。 

变性步骤：循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不，易造成扩增失败。 

引物退火：退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

引物延伸：引物延伸一般在72℃进行（Taq酶***适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

循环数：大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

***后延伸在***后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。

普通的PCR仪

把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，叫传统的PCR仪，也叫普通PCR仪。

它是由主机，加热模块，PCR管，热盖，控制软件组成。根据DNA部分片段高温解链，降温配对聚合原理，通过循环改变加热模块的温度，微量不易于分辨的的DNA部分片段进行扩增成大量的DNA部分片段，反转录预混液，从而对其进行分析鉴定。根据需要可结合电泳仪，水平电泳槽，一起应用。如果要做不同的退火温度需要多次运行。主要是做简单的，对目的***退火温度的扩增。

该仪器主要应用于***临床检验，食品检测，科研机构，高等院校教学对遗传变异，***表达等进行研究。