友名生物技术-DNA标记

传统小分子特异性antibody制备技术

为解决小分子这类半抗原物质无法刺激宿主动物产生antibody的特性，必须将半抗原回复完全抗原的特性。解决这个问题可以通过将小分子和对宿主动物immune原性很强的物质：如OVA、BSA、KLH等偶联，将其制备成完全抗原，通过immune宿主动物，便能促使宿主动物产生针对小分子的特异性antibody，这类antibody通过抗原特异性的筛选便能获取目的antibody。目前，通过此项技术能解决绝大多数小分子特异性antibody的制备，但是也可能由于小分子的结构特异，偶联物和偶联方式的选取、偶联率的差异以及immune技术有待发展等多方面的因素使其特异性antibody的制备存在困难。

水中微生物DNA提取***盒，样本制备步骤。

步骤1. 样本过滤

1.1 从***盒中小心取出滤膜。用水样润湿滤膜。

1.2 将滤膜放置在滤器中，并过滤必要体积的水样。

步骤2. 菌体裂解

* 提前准备：预先将恒温仪设置到70℃，将恒温箱设置到37℃。

2.1将样本过滤后的滤膜翻转放置到***盒提供的IncubationDish（平皿）中。

2.2 吸取2mllysis buffer（裂解液），并加到滤膜上。

2.3 将滤膜浸泡在裂解液中，小心摇匀平皿并在37°C孵育30分钟。

2.4 用平皿中的裂解液冲洗滤膜，并摇晃平皿10秒钟。

2.5 将平皿中的400μl裂解液转移至IncubationTube（孵育管），70°C孵育10分钟。

2.6 样本短暂离心，并加入400μl Binding Buffer（结合液），立即涡旋充分混匀，以防止DNA沉淀。请勿离心样本，并立即进行下一步。

步骤3. DNA提取

3.1 将步骤2.6中的混合液（~800μl）转移到CollectionTube（收集管）内的SpinColumn（离心柱）中，小心液体不要沾到离心柱的边缘。

3.2 离心柱离心≥10000× g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.3 离心柱中加入500μl洗液1。离心≥10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.4 离心柱中加入500μl洗液2。离心≥10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。将离心柱插到一个新的收集管中。

3.5 ***大速度离心3分钟，以去除残留的洗液2。

3.6 弃掉收集管。

3.7 吸取60μl已70℃预热的洗脱液，直接加到离心柱的硅胶膜上。硅胶膜表面应全部覆盖洗脱液。

3.8 室温静置2分钟，然后离心8000×g，2分钟，以洗脱DNA。

3.9 样本保存管中的洗脱液即包含DNA，可直接用于PCR，或储存在2~8℃，可存放1周。长期储存是在≤-18℃。

在选用支原体PCR法检测来替代药典方法时，需要考虑如下两个方面：

首先一步是要使用符合欧洲药典要求，经过全方面验证的支原体检测***盒，第二部是自我验证，即确认所用的样本基质对于该***盒方法是合适的，并且操作过程是正确的。小规模的室内验证通常需要采用三个不同批次的***盒，然后加入10CFU的标准品，做复孔（通常是8个复孔），并且至少选择3个支原体物种进行验证。

有的支原体标准品厂家会提供CFU与基因拷贝数的比值，以方便二者的换算。因为10CFU只能确定PCR能够达到的检测限在10CFU以下，DNA标记，但无法具体确定灵敏度的数值。带DNA拷贝数标定的基因组DNA标准品则可进一步确定检测限的数值。

总之，PCR方法很有用，但需要避免假阴性，验证时应使用阳性对照、阴性对照、无模板对照和内控对照，以保证PCR反应正常，以及支原体少量存在时确实能检出来，支原体不存在时也确保是结果阴性，从而使得PCR方法在工业应用时能确保***终结果的可靠。