DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，及在将其连接到载体上
这三个连续的步骤在连接酶的三个不同域进行，与双链DNA接触的各个域环绕DNA底物形成反应域。DNA连接酶主要用于产生新的核酸分子组合，以及在分子克1隆前将其连接到载体上。
用于分子克1隆的DNA连接酶是***来源或者噬菌体编码。所有真***，无论是嗜热或嗜温，包含一个单一的连接酶***，编码NAD*-依赖型的酶(Olivera and Lehman1967; Takahashi et al. 1984)。
在连接反应的第yi步中， 使用NAD的二磷酸作为磷酸1酐键和腺营基团转移到DNA连接酶赖氨酸残基的ε-氨基基团。腺苷酸残基然后转移到DNA底物的5-磷酰基末端，变得易于受到并列的3"羟基基团的亲核攻击。
这导致磷酸二酯键的形成，消去AMP，以及形成DNA链的共价连接。用于分子克1隆的DNA连接酶在连接非经典底物时能力有所不同，如平末端双链、DNA-RNA杂交体或单链DNA.这些以及其他的属性归纳于表5。分子克1隆中比较常用的催化体外连接的酶是T4噬菌体编码的DNA连接酶。
据研究表明RNA聚合酶拥有现代蛋白质聚合酶的许多特征，它可以进化从而识别出RNA启动子，然后copy RNA。研究意味着，dNTP Mixture，生命进化早期出现的同样的RNA酶也可能表现出如此复杂的生物学特征。
有证据表明，RNA先于DNA和蛋白质出现。例如，***细胞内制造蛋白质的“机器”核糖体就由RNA制造而成。此外，DNA也由RNA组成。由于RNA是一种万1能工具，可以同时发挥蛋白质和DNA的功能，这表明后来进化出现的DNA和蛋白质是一种“升级”，以增强起初由RNA支持的细胞功能。昂劳实验室发现的聚合酶表明，RNA copy在原始生命体内确实可能存在。
T4 RNA连接酶
用途：用RNA 3"末端标记；RNA和RNA分子间连接；寡核苷酸的环化；tRNA修饰；5" RACE中寡核苷酸连接到cDNA单链；在蛋白质特***点引入非天然氨基酸。
来源：由大肠杆1菌表达，表达***的来源为T4嗜菌体。
活性定义：37℃30分钟内，催化1 nmol 5"-[P]-(A)12-18成为磷酸酶不能消化的环形产物所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：50mM Tris-HCl(pH7.5)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，10μM 5"-[P]-(A)12-18(10μM in 5"-termini)。
纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷1酸酯酶。
酶储存溶液：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM DTT，50mM KCl，0.1mM EDTA，50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：500mM HEPES-NaOH(pH8.0 at 25℃)，100mM MgCl2，100mM DTT。
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