DNA限制性内切酶酶切
影响条件：DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
处理方法：当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的***适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第yi个酶切反应完成后，mRNA切割酶，用等体积酚/氯1仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
限制酶分布区域
限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有***的属、种中都发现至少一种限制性内切酶，多者在一属中就有几十种，例如在嗜血杆1菌属中（Haemophilus）现已发现的就有22种。有的菌株含酶量极低，很难分离定性；然而在有的菌株中，酶含量极高．如E. coli的pMB4(EcoRI酶）和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶）就是高产酶菌株。据报道从10g的H. aegyptius的细胞中，能分离提纯出可消化l0gλ噬菌体DNA的酶量。***是限制性内切酶，尤其是特异性非常强的I类限制性内切酶的主要来源。
错位切割含目的***的DNA部分片段和运载体一形成黏性末端
单酶切：同一种限制酶分别切割含目的***DNA部分片段与运载体。这是较简单的一种方法，含目的***的DNA部分片段与运载体在同种限制酶作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对而连接，进而形成重组DNA分子。
用同裂酶去切割含目的***DNA部分片段与运载体。有一些来源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂酶(同切酶或异源同工酶)。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏性末端。
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