通用RNA提取-武汉友名生物公司(图)

PCR产物的回收（胶回收***盒）

1.胶回收的目的（1）去除非特异性扩增的产物（2）去除多余的底物（3）去除多余的Taq酶（4）得到目的片段

2.胶回收的过程（1）切胶：紫外下切胶，称重。之后用头将胶块捣碎。切胶的刀片建议选用一次性刀片，实验台等也尽可能用乙醇擦拭干净。可通过空EP管与装胶EP管质量的差值计算胶的质量。注意切胶时尽可能避免切到条带外的凝胶，且避免紫外时间过长。别忘记胶条有厚度，前后多余的部分也尽量切除。（2）溶胶：每1 mg胶加入1 μL膜结合液（MB），按比例1:1加入MB，55℃水浴溶解。每1~2 min震荡混匀，待溶解后至少在水浴中保持1~2 min，保证胶块完全溶解。在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密结合，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解DNA才能充分释放。否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。（3）结合：将溶胶转移至纯化柱内，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将纯化柱重新插回收集管中。胶块完全溶解后建议将胶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在温度较高时结合DNA的能力较弱。

如何确认RNA的质量

实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估***的活力。RNA样本提取的质量直接影响***表达分析。影响RNA品质的因素有以下三种：RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。

检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：

紫外分光光度计法：

测量260nm吸收值计算RNA浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估RNA纯度。需要注意的是：在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。

260nm/280nm的比值范围在 1.9~2.1 之间。＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明RNA可能发生降解。

琼脂糖凝胶电泳：

完整的RNA通常有三条带，***亮的是28S条带，其次是18S条带，***淡的是5S条带（部分***盒提取时会过滤掉5S条带）。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。

如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利，28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量***好。

若RNA条带出现弥散，原因可能：RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。

为什么用无水乙醇沉淀DNA

　　用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中较常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶， 乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

　　DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，通用RNA提取，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的***终含量占67%左右。 因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)。

　　但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大， 尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵， 后面的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙1醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15-30分钟即可。