小RNA纯化-友名生物公司(图)

ELISA定性测定

定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或antibody作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的***高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

在间接法和夹心法ELISA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。

水中微生物DNA提取***盒，样本制备步骤。

步骤1. 样本过滤

1.1 从***盒中小心取出滤膜。用水样润湿滤膜。

1.2 将滤膜放置在滤器中，并过滤必要体积的水样。

步骤2. 菌体裂解

* 提前准备：预先将恒温仪设置到70℃，将恒温箱设置到37℃。

2.1将样本过滤后的滤膜翻转放置到***盒提供的IncubationDish（平皿）中。

2.2 吸取2mllysis buffer（裂解液），并加到滤膜上。

2.3 将滤膜浸泡在裂解液中，小心摇匀平皿并在37°C孵育30分钟。

2.4 用平皿中的裂解液冲洗滤膜，并摇晃平皿10秒钟。

2.5 将平皿中的400μl裂解液转移至IncubationTube（孵育管），70°C孵育10分钟。

2.6 样本短暂离心，并加入400μl Binding Buffer（结合液），立即涡旋充分混匀，以防止DNA沉淀。请勿离心样本，并立即进行下一步。

步骤3. DNA提取

3.1 将步骤2.6中的混合液（~800μl）转移到CollectionTube（收集管）内的SpinColumn（离心柱）中，小心液体不要沾到离心柱的边缘。

3.2 离心柱离心≥10000× g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.3 离心柱中加入500μl洗液1。离心≥10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。重新将离心柱插到原有的收集管中。

3.4 离心柱中加入500μl洗液2。离心≥10000×g，1分钟。弃掉收集管中的液体。将离心柱插到一个新的收集管中。

3.5 ***大速度离心3分钟，以去除残留的洗液2。

3.6 弃掉收集管。

3.7 吸取60μl已70℃预热的洗脱液，直接加到离心柱的硅胶膜上。硅胶膜表面应全部覆盖洗脱液。

3.8 室温静置2分钟，然后离心8000×g，2分钟，以洗脱DNA。

3.9 样本保存管中的洗脱液即包含DNA，可直接用于PCR，小RNA纯化，或储存在2~8℃，可存放1周。长期储存是在≤-18℃。

PCR产物的回收（胶回收***盒）

1.胶回收的目的（1）去除非特异性扩增的产物（2）去除多余的底物（3）去除多余的Taq酶（4）得到目的片段

2.胶回收的过程（1）切胶：紫外下切胶，称重。之后用头将胶块捣碎。切胶的刀片建议选用一次性刀片，实验台等也尽可能用乙醇擦拭干净。可通过空EP管与装胶EP管质量的差值计算胶的质量。注意切胶时尽可能避免切到条带外的凝胶，且避免紫外时间过长。别忘记胶条有厚度，前后多余的部分也尽量切除。（2）溶胶：每1 mg胶加入1 μL膜结合液（MB），按比例1:1加入MB，55℃水浴溶解。每1~2 min震荡混匀，待溶解后至少在水浴中保持1~2 min，保证胶块完全溶解。在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密结合，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解DNA才能充分释放。否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。（3）结合：将溶胶转移至纯化柱内，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将纯化柱重新插回收集管中。胶块完全溶解后建议将胶液温度降至室温再上柱，因为纯化柱在温度较高时结合DNA的能力较弱。