饲养层细胞制备
于细胞融合前一天，准备饲养层细胞，常选用小鼠腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是: 一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死0亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的数目应适宜，过少则不能提供杂交瘤细胞所需要的生长因子，过多会阻碍杂交瘤细胞的贴壁，一般以铺满孔底 30% 为好。
1. 第21天按同样方式加强免0疫1针。备注：每次佐剂和抗原现配现用。
2. 第35天采微量血进行ELISA测定，抗0体滴度应在1:10000-1:10000000范围内，随后即可采全血或按常规方法进行抗原冲击免0疫和脾细胞融合。
3. 若抗0体滴度没有达到要求，可在第42天按同样方式加强免0疫1针。备注：通常情况下小鼠只需免0疫2针，而家兔往往需要免0疫3针。
4. 若免0疫3针，可在第52-56天采微量血进行ELISA测定，抗0体滴度应在1:10000-1:1000000范围内，随后即可采全血或按常规方法进行抗原冲击免0疫和脾细胞融合。备注：佐剂免0疫效果有时也与抗原特性有关，核酸染料，若免0疫3针后仍达不到要求，不建议进行更多针次免0疫。
腹0水的纯化
采集复水后，12 000 r/min 离心 15 min，去掉 沉淀等杂质。往离心后的腹0水中加入等体积的 PBS，并添加***铵固体至 50% 饱和，静置 2 h，12 000 r/min离心15 min，弃 上 清，用 PBS 重 新 溶 解 沉 淀，然 后 再次加入***铵固体至 45% 饱和，静置两个小时左右，12 000 r/min 离心 15 min 弃去上清，用少量 PBS 溶解沉淀，即得到较纯的抗0体，对 PBS 透析除去***铵，透析时间为24 h，透析过程中更换透析液两至三次。
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