pcr实验室-pcr-南京英瀚斯

腺病毒包装原理介绍

腺病毒是一种没有包膜的直径为79-90nm的颗粒，由252个 壳粒呈二十面体排列构成。每个壳粒的直径为7-9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，两端各有长约100bp的反向重复序列。***腺病毒 已知有33种，分别命名为ad1-ad33，研究详细得是ad2.

腺病毒是一种无包膜的球型结构的病毒，遗传物质为线型 双股DNA形式。腺病毒的特点：（1）gan染范围广对人致病性低；（2）对增殖和非增殖细胞均具有gan染性；（3）能有效进行增殖；（ 4）病毒滴度高；（5）不整合到染色体中，无插入致突变性；(6)外源***装载容量大。由于腺病毒的这些特点使其广泛地应用于体 外***转导、体内接种yi苗、和***zhi疗等各个领域。

实验方法

1.获得目的***序列；

2.构建病毒表达载体质粒；

3.表达载体质粒和包装质粒重组；

4.gan染HEK293，包装出病毒；

5.病毒扩增、浓缩；

6.滴度测定。

分子实验介绍——荧光定量PCR检测

荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，荧光定量pcr，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。Sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。

SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，pcr实验室，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或***RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。

结果示例：

图 A ***扩增曲线图；B ***扩增溶解曲线图；C mRNA相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。

DNA测序检测

1. PCR测序反应

(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，pcr，按下表加***:

所加***测定模板管标准对照管

BigDye Mix

1μl

1μl

待测的质粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf (+)双链DNA

-1μ1

待测DNA的正向引物

1μ 1

M13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

2μ 1

总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，

PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°***min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。

2.乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C离心30 min，小心弃上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min，小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。

(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min)，冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与***。