pcr检测-pcr-英瀚斯生物科技(查看)

1、细胞准备：细胞传到后，密度达到70％左右时进行转染；

2、细胞转染:取两个EP管，一个加入Opti-MEM、质粒和包装质粒；另一个加入Opti-MEM、lipo2000，pcr，然后将两管混匀；

3、细胞孵育：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；

4、收集病毒：转染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

5、滴度检测:细胞为30%－50％时加入病毒上清液，检测阳性细胞比例。

lncRNA测序

长链非编码RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）一般是指长度大于200 nt的RNA，位于细胞核内或胞浆中，不参与蛋白质编码功能，PCR，以RNA形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控***的表达水平，在生命活动中具有重要作用。

长链非编码RNA测序（long non-coding RNA sequencing，lncRNA-Seq）是一种使用特定方法降低样本中rRNA 的丰度，对富集到的 RNA进行文库构建，再对高通量测序仪产出的数据进行信息分析的研究方法。lncRNA-Seq可一次性获得样本中全部的lncRNAs信息，对lncRNAs的类别、功能进行的深入分析，从而快速准确地获得与特定生物学过程（例如发育、***等）相关 lncRNA信息。

DNA测序检测

1. PCR测序反应

(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加***:

所加***测定模板管标准对照管

BigDye Mix

1μl

1μl

待测的质粒DNA

1μ 1

pGEM-3Zf (+)双链DNA

-1μ1

待测DNA的正向引物

1μ 1

M13(-21)引物- 1μ 1

灭菌去离子水

2μ 1

2μ 1

总反应体积5μ 1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，

PCR循环参数为96C 10s， 50C 5s， 60°***min， 25 个循环，扩增结束后设置4C保温。

2.乙醇法纯化PCR产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。

(2)加入25μ 1/乙醇混合液，充分振荡，pcr检测，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于

4C离心30 min，小心弃上清。

(3)加70%(V/V)的乙醇50μ 1 洗涤沉淀2次。12 000r/min 于4C离心5min，小心弃上清和

管壁的液珠，真空干燥沉淀10~ 15min。

3.电泳前测序PCR产物的处理。

(1)加入12μ 1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2)将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。

(3)在PCR仪上进行热变性(95C 2min)，冰中骤冷，待_上机。

4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立

运行的测序顺序文件。

5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过

序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与***。