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分子与质粒载体构建

实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；后产生一个新的磷酸二酯键，pcr检测，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可大限度地发挥连接酶的活性，pcr实验室，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

单核苷酸多态性( SNP )实验

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性 ，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计，在人类***组中，大约每千个碱基中有一个SNP ，无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ，都要广泛得多。

实验方法原理:

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计，在人类***组中，大约每千个碱基中有一个SNP ，无论是比较于限制性段长度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ，都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的单位，据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。-般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。 于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型( haplotype b大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率)，它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。-个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一-旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行***分型，获取大部分的遗传多态模式。

  全转录组测序    

全转录组是指特定***或细胞在特定状态下所有转录产物的总和，包括mRNA和各种noncoding RNA。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络，如果只是对某个单一RNA分子的研究，有时并不能准确的发现分子作用机制。而竞争性内源RNA(ceRNA)理论阐述了一种全新的转录调控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假***等）分子能够通过miRNA应答元件（microRNA Respe Element， MRE）竞争性地结合相同的miRNA来调节彼此的表达水平。举个例子：miRNA会导致***沉默现象发生，而如果lncRNA竞争性结合了miRNA，四川pcr，从而影响了miRNA***沉默功能实现。

      ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一，通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。目前对全转录组简便的方法就是构建2个测序文库分别进行测序。标准的生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究内容，PCR，靶向调控网络、ceRNA网络、共表达网络分析可以将这几种RNA联合起来分析，从而发现新的调控网络模型。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了***all RNA的信息，所以需要另外再构建一个***all RNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他***all RNA的鉴定及注释信息。全转录组测序方案路线图如下所示：