




蛋白质质谱鉴定服务
蛋白质(protein)是有机大分子,是构成细胞的基本有机物和生命活动的主要承担者。蛋白质在催化生命体内各种反应进行、新陈代谢、抵御外来物质入l侵及控制遗传信息等方面都起着重要的作用。蛋白质的一级结构是氨基酸序列,通过鉴定氨基酸序列来匹配它的蛋白质,雅安pcr,这是定性研究,是蛋白质组学的基础,也是蛋白质组学的重要技术之一。
质谱一般由离子源、质量分析器(Mass analyzer)和离子检测器(Detector)三部分组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析,但随着新的离子化技术的出现,如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)等,质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的途径。现在蛋白质组学基本研究手段是:以生物质谱技术为,对蛋白质进行大规模、高通量分离、鉴定和分析。
蛋白质质谱鉴定的基本原理是用蛋白酶将蛋白质消化成肽段混合物,经MAILDI或ESI等软电离手段将其离子化,然后通过质量分析器将具有特定质核比的肽段离子分离开来。通过实际谱图和理论上蛋白质经过蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行的比对,进行蛋白鉴定。

◆ HPLC
如果合成的寡核苷酸应用于,定向诱变或定量的***探测,那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求,PCR,则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂,阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率,对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度,用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸(大于35-mer)。
◆ PAGE
对于长的寡核苷酸的纯化(50-100mer),我们推荐PAGE纯化法,它使用交连的聚酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管PAGE显示出高的纯化效率(>98%),实时荧光定量pcr,但它在额外的步骤方面有一些缺陷,比如在PAGE之后需要提取和脱盐,继而将导致纯化产率的下降。
22.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?
答:通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。同样道理,用EB染色来照片不适合所有引物。
23.引物不纯会有什么后果?
答:引物不纯可能会导致:1)非特异性扩增;2)无法用预先设计在引物5′端酶切位点的酶切开,特别是没有保护碱基的引物;3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。
24.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?
答:如果溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mMT ris pH7.5缓冲液溶解引物,PCR实验室,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

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