RNA提取
1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。
2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。
3.加1ml TRIZOL研磨B 41。
4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。
6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号EP管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充
分混匀。4C冰箱35min。
10. 4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.
11.弃去.上清液，加1m175%乙醇，轻摇7]。
12. 4C离心，10600转/分钟，苏州pcr，时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。
***RNA提取
1、剪米粒大小***块放入EP管中标号。
2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨，pcr检测，以肉眼很难看到***为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
慢病毒包装
1、细胞准备：细胞传到后，密度达到70％左右时进行转染；
2、细胞转染:取两个EP管，一个加入Opti-MEM、质粒和包装质粒；另一个加入Opti-MEM、lipo2000，然后将两管混匀；
3、细胞孵育：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；
4、收集病毒：转染后48h、72h收集含慢病毒的上清；
5、滴度检测:细胞为30%－50％时加入病毒上清液，检测阳性细胞比例。
25.PCR扩增不出就引物有问题吗？
答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出、扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增那些拷贝数很低的***片段。 有些重复片段的扩增， GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。
引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见：
（1） RT-PCR。请注意，很多***通过常规RT -PCR方法是很难扩增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT的反应的RNA质量和目标***在特定***和细胞中含量。
（2）从***组中扩增。一般情况下，荧光定量pcr，***在***组中都是单拷贝，***组作为模板需要严格控制用量。***组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH
fish检测-英瀚斯生物科技公司-苏州pcr由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司是江苏 南京 ,技术合作的见证者，多年来，公司贯彻执行科学管理、创新发展、诚实守信的方针，满足客户需求。在英瀚斯***携全体员工热情欢迎各界人士垂询洽谈，共创英瀚斯更加美好的未来。
