分子实验介绍——荧光检测
细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原***的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达***。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白***和表达的实验方法。
实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-DAPI染色-荧光显微镜拍照或激光共聚焦显微镜拍照。
结果示例：
细胞荧光染
通过观察细胞中蛋白的荧光强度和***分析该蛋白的表达变化。
9.如何计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：
Tm = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size
公式中，Size = 引物长度。
Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents， like formamide or urea，荧光定量pcr， Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati f***or hybrid formation， which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.
5.长可以合成多长的引物？
答：引物越长，出现问题的概率就越大。有的公司合成过120base的引物，产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，的产量很低。
6.需要合成多少OD数？
答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做***拼接或退火后做连接，***检测怎么做，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全***构建的引物都比较长，pcr检测，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长， 全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，西安pcr，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
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