聚合酶链式反应(PCR)
操作步骤
1.在冰浴中，fish检测，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
1QPCR buffer
5 μl
dNTP mix( 2mM )
4 μl
引物1(10pM)
μl 2
引物2 ( 10pM)
2μl
Taq酶(2U/ul)
1 μl
DNA模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddH2O至
μl 50
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C
预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，循环30-35
次，后在72°C保温7min。
3.结束反应， PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。
4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以
除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。
通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
收集细胞后装载探针：按照1：1000用无培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/毫升，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照及自己感兴趣的刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20-30分钟后可以显著提高活性氧水平。
2.、检测
对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，攀枝花pcr，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光或流式细胞仪检测。
对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ 脱盐
寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-乙氧基--磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。然而，必要的去保护步骤完成后，***检测怎么做，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，pcr检测，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ＰＣＲ检测等基础生物研究。
◆ BioRP / OPC纯化
如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成，则N-寡核苷酸包含5’-DMT基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为DMT基有强的亲脂的特性，有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－DMT寡核苷酸存在强亲和力，但是提前终止的寡核苷酸不包含DMT基团，所以，我们能够成功的把想要的N-寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。
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