二、操作步骤：
1. 所有在纯化系统里使用的溶液当日都需要经过 0.22μm 的滤膜抽滤、脱气处理；保存 4℃ 冰箱里的缓冲液若要在室温使用需***至室温后抽滤脱气；
2. 样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用离心（13000rpm，10min）；
3. 依次用水、缓冲液洗泵；设置流速和柱前警报压（压力值参阅层析柱及填料说明书，取较小的一个大耐受压力）。防止柱中进入气泡，影响分离效果；
4. 当柱子限压在 0.3MPa，或者在限压状态下流速很低时，fish检测，pH valve 中的 Restirtor 可以切换成 Off line，即显示 By-pass 状态；
5. 当需要通过仪器上样环上样时，将 W1 阀口处换成带透明短软管的阀门，从此处阀门位通过倒吸样品上样；
6. 进样阀「Inject」为上样状态。上样结束可将进样阀切换回「Load」状态。并用纯水认真清洗上样环至少 3 次；将 W1 阀口处换回原来接头阀门。
7. 纯化结束后，用纯水清洗泵和平衡柱子；再用 20% 的乙醇清洗泵以及系统。长期不用，实时荧光定量pcr，层析柱应保存在 20% 的乙醇中，泵放置在 20% 乙醇中；
8. 实验结束后及时倾倒废液瓶里的废液；
关于引物的常见问题汇总:
1. 引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种， 主要都是由ABI/PE 公司生产，而Bioneer自行研制的384并行高通量DNA合成仪，可实现99%的高合成率。无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，***消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA，具有、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接。
步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯反应，脱去其5′-羟基的保护基团DMT，获得游离的5′-羟基。
第二步，合成DNA的原料，镇江pcr，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有数5′-羟基没有参加反应(少于2%)，用酐和1-咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯脱去它的5′-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，和PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩、脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
单核苷酸多态性( SNP )实验
SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性 ，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计，在人类***组中，大约每千个碱基中有一个SNP ，无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ，都要广泛得多。
实验方法原理:
SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphi***)。据估计，在人类***组中，大约每千个碱基中有一个SNP ，pcr检测，无论是比较于限制性段长度多态性(RFLP)分析还是微标记(STR) ，都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的单位，据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。-般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。 于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型( haplotype b大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型(每个具有至少5%的频率)，它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。-个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一-旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行***分型，获取大部分的遗传多态模式。
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