甘肃细胞-英瀚斯生物科技公司-细胞融合实验报告

小鼠精原gan细胞分离富集和培养

成年小鼠gao丸中约有108个细胞，其中约有 2×104个是精原gan细胞，仅占gao丸生精上皮细胞总数的 0.02～0.03%，精原gan细胞数量太少不利于体外培养.分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件.寻找分离和富集小鼠精原gan细胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠为实验对象，先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min，甘肃细胞，用胎牛xue清终止消化，细胞实验外包，用一次40-um孔径的滤器过虑制成单 细胞悬液，30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞，再根椐未分化精原gan细胞表面thy1.2(CD90.2)阳性CD117(c- kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来，并在体外进行培养尝试. 结果:30%percoll密度梯度离心前CD117(c-kit)阳性细胞占13.80±3.34%，CD90.2阳性细胞占28.98±4.51%， 二者都阳性细胞占8.98±2.98%，CD117阴性CD90.2阳性细胞占18.36±2.67%;离心后 CD117(c-kit)阳性细胞占12.37±3.34%，CD90.2阳性细胞占56.98±4.51%，二者都阳性细胞占 8.20±3.98%，细胞融合实验报告，CD117阴性CD90.2阳性细胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后 比较差异无显著性(P>0.1)，CD90.2阳性细胞和CD117阴性和CD90.2阳性细胞所占百分比前后比较差异有显著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作为标志分子，细胞培养，percoll离心后细胞悬液经FACS分选后获得细胞纯度

2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]：

(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时，使其达到 50～60% 板底面积。

(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下：

①在 1 mL 无 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。

②旋转 1 秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。

③室温下放置 5～10 分钟，使 DNA 结合在脂质体上。

(3) 弃去细胞中的旧液，用 1 mL 无 DMEM 洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物，37℃ 培养 3～5 小时。

(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM，继续培养 14～24 小时，

(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM，2 mL/孔，再培养 24～48 小时。

(6) 用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下：

(1) 接种细胞同前，细胞长至 50% 板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。

(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM，37℃ 培养 48 小时。

(4) 吸出 DMEM，用 G418 选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染，方法参照细胞筛选法进行。

透射电镜观察自噬小体方法

利用光学显微镜，借助相应的染色方法，可以观察细胞凋亡时会出现的一系列形态特征。常用的染色法包括台盼蓝、橙 / 化乙啶（AO/EB）、Giemsa 和 HE 法等。在光学显微镜下可以观察到核固缩、质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡现象。

电镜形态学观察法是一种比较经典、可靠的方法，被认为是确定细胞凋亡的金标准。电镜下凋亡细胞表现为染色质凝集、核浓缩、核裂解、胞浆收缩和胞膜具有发泡现象及凋亡小体出现等。