pcr检测-英瀚斯-广安pcr

◆　HPLC

如果合成的寡核苷酸应用于，定向诱变或定量的***探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，pcr检测，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-mer寡核苷酸的纯化是充分的。反向树脂化的HPLC与阴离子交换树脂的HPLC呈现相似的纯化效率。因为HPLC的纯化效率很大程度依靠寡核苷酸的长度，用HPLC法不能有效纯化长的寡核苷酸（大于35-mer)。

◆　PAGE

对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。

分子实验介绍——印迹（Western blot）检测

通过SDS-PAGE凝胶将细胞或生物样品内的蛋白按照蛋白分子量从大到小规律分离开。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或PVDF膜）上，实时荧光定量pcr，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的起反应，再与酶或同位素标记的第二起反应（目前主要用HRP标记的第二），经过底物显色或自显影以检测电泳分离的特异性目的***表达的蛋白成分（目前主要使用鲁米诺和二抗中的HRP反应发出荧光，通过仪器或者胶片显色）。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验流程：细胞收集-细胞裂解，蛋白提取-蛋白变性-SDS-PAGE电泳-蛋白质转膜印记-蛋白封闭-目的孵育-二抗孵育-显色拍照

结果示例：

图 A不同大小的质粒转染细胞后，Western blot检测图片；B A蛋白不同培养时间后Western blot检测图片；C 使用Image pro plus软件对A蛋白灰度检测，A蛋白表达变化统计图

二、大肠菌群检验方法:

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的***，fish检测，即:需氧及兼性厌氧、在37°C能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有和原***商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。

(一):采用三步法，即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36士1C培养48土2h，观察是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36士1°C培养18-24h，观察菌落形态。证实试验:挑取平板上的菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36士1°C培养24土2h，观察产气情况。

报告:

根据证实为大肠阳性的管数，查MPN表，报告每100ml ( g)大肠菌群的MPN值。具体操作参见GB4789. 3-94 《中华人民共和***品卫生微生物学检验大肠菌群测定》

(二)原***商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠进行检测。本方法采用两步法：推测试验:样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36士1C培养48士2h，观察是否产气。证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中，广安pcr，36士1°C培养48士2h，观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表，报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠检验方法》