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层析柱装柱步骤流程

1.计算每厘米柱床高度填料的数量；

2.选择合适的配件和末端筛网，选择不合适的滤网可能导致较高反压或填料***；

3.选择装柱流速

首先：拍排泡

第二：调水平

第三：匀浆

第四：装柱

第五： 绘制压力/流速曲线，装柱流速为大流速的70%-100%。

柱效检测

柱效主要取决于装柱质量。如果是离子交换或亲和层析填料，则不能使用有色物质，如蓝色葡聚糖。表征柱效的两个指标是理论板当量高度（HETP）和对称因子As，使用N***或通过测定UV吸收或电导率进行计算。

使用N***溶液进行测定，优点样品是易得、安全，缺点是可能与填料发生反应，特别是离子交换树脂，因此影响测定结果。使用进行测定，其不与层析填料发生反应，并且可通过检测280 nm处的紫外吸收进行测定，并且，测定缓冲液的浓度可提高至10倍。

凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的空隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分s子大小不同而被分离。

层析柱的操作方法1.层析柱再生、平衡有效成分经TLC检识全部流出后，用纯5000ML再生，一(5：95)平衡后，可再次上样，反复使用(使用次数随原料不同而异，一般可连续使用2—6个月以上)。2.重结晶冬凌草甲素结晶析出完全后，减压过滤，然后用少量洗涤(洗涤液保留，作下次热溶冬凌草甲素用)。将冬凌草甲素再用适量热溶后放置，结晶再次析出，待结晶完全后，树脂柱价格，抽滤，用少量洗涤，将结晶室温下晾干后置真空干燥箱中，35度真空干燥至恒重。密封于瓶中，置干燥器中保存。3.薄层层析分析取适量冬凌草甲素对照品及由上述方法得到的冬凌草甲素样品溶解后点于同一硅胶G薄层板上，树脂柱生产厂家，以一(8：2)为展开剂进行展开，树脂柱，5% 香草醛乙醇液显色，于105。C烘至斑点清晰。表明在该展开系统下，冬凌草甲素样品和对照品都具有相同的RF值，并呈现出同样的蓝绿点，在制备的冬凌草甲素样品中，没有杂质斑痕。