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染色质免l疫共沉淀技术(ChIP)

基于体内分析而发展的染色质免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit，***检测多少钱， ChIP)技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l细胞或者***的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与***表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体***表达调控区域检查染色体活性，是深入分析***l症、心血l管病以及******系统紊乱等***主要通路的一-种非常有效的工具。

染色质免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l细胞状态下，pcr引物设计，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内，当F与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为-定长度范围内的染色质小片段然后通过抗原抗l体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNAl片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，pcr检测，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。

聚合酶链式反应(PCR)

操作步骤

1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

1QPCR buffer

5 μl

dNTP mix( 2mM )

4 μl

引物1(10pM)

μl 2

引物2 ( 10pM)

2μl

Taq酶(2U/ul)

1 μl

DNA模板( 50ng-1μg/μl )

1 μl

加ddH2O至

μl 50

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上执行扩增。-般:在93°C

预变性3-5min ，进入循环扩增阶段: 93°C 40s→58°C 30s→72°C 60s ，循环30-35

次，后在72°C保温7min。

3.结束反应， PCR产物放置于4°C待电泳检测或-20°C长期保存。

4. PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油，需用100ul进行抽提反应混合液，以

除去石蜡油;否则，直接取5- 10μl电泳检测。

蛋白提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液， 少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丁醇等有ji溶剂中，因些，可 采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

(一)水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶 解，缩短提取时间。但另一方面. ，温度升高会使蛋白质变性失活，广西pcr，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温( 5度以下)操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白 水解酶抑zhi剂(如二yi丙基氟磷酸，碘yi酸等)。