***检测怎么做-资阳pcr-英瀚斯生物科技

20.Primer设计的基本原则是什么？

答：引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3"端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3"端5个碱基有2个以上的G或C。

◆如果可能避免在3"端1个碱基为A。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，资阳pcr，怎么会有蛋白质污染？引***学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

9.如何计算引物的Tm值？

答：引物设计软件都可以给出Tm，***检测怎么做，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。

长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：

Tm =            4℃   (G + C)+ 2℃   (A + T)

对于更长的寡聚核苷酸，dna检测，Tm计算公式为：

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物长度。

Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents， like formamide or urea， Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati f***or hybrid formation，实时荧光定量pcr， which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.

蛋白质双向电泳实验流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL，否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。

(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。

(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶 45min，15W/胶 5-8hr，20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描：凝胶染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。

(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以***小点面积30，平滑度2为主要参数***大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。