20.Primer设计的基本原则是什么？
答：引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3"端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3"端5个碱基有2个以上的G或C。
◆如果可能避免在3"端1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆退火温度Tm控制在 58-60C 左右。
◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。
21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？
答：引物应该全是DNA，pcr，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引***学合成，哪里有机会污染到蛋白质？需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
RNA提取
1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。
2.弃去PBS，用1000u1吸干净残余PBS。
3.加1ml TRIZOL研磨B 41。
4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。
5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。
6.往每个EP管中加入250ul，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。
7. 所有样品4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.
8. 再次标记一批同样编号EP管。
9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充
分混匀。4C冰箱35min。
10. 4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.
11.弃去.上清液，pcr实验室，加1m175%乙醇，轻摇7]。
12. 4C离心，10600转/分钟，时间: 5min.
13. 弃上清液滤纸吸干。
14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。
***RNA提取
1、剪米粒大小***块放入EP管中标号。
2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。
3、用研磨棒研磨，pcr引物设计，以肉眼很难看到***为宜。
4、加700u1 trizol静 置5分钟。
3、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。
4、其它说明
阳性对照可以按照1：1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1毫升，可以加入1微升的阳性对照刺激。通常刺激后20-30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。
另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1：2000-1：5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2-5微摩尔/升。探针装载的时间也可以根据情况在15-60分钟内适当进行调整。
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