pcr-南京英瀚斯生物科技-pcr实验室

18.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，实时定量pcr，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。

19. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

答：下列原则供您参考。

◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。

◆长度一般为18-40mer 。

◆G-C含量控制在40-80%左右。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆在引物的5"端避免使用G。

◆选用比较多的碱基C。

◆退火温度Tm控制在 68-70C   左右。

有用的荧光染料参数

蛋白质质谱鉴定服务

蛋白质（protein）是有机大分子，是构成细胞的基本有机物和生命活动的主要承担者。蛋白质在催化生命体内各种反应进行、新陈代谢、抵御外来物质入l侵及控制遗传信息等方面都起着重要的作用。蛋白质的一级结构是氨基酸序列，pcr，通过鉴定氨基酸序列来匹配它的蛋白质，这是定性研究，是蛋白质组学的基础，也是蛋白质组学的重要技术之一。

质谱一般由离子源、质量分析器（Mass analyzer）和离子检测器（Detector）三部分组成。传统的质谱仅用于小分子挥发物质的分析，但随着新的离子化技术的出现，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)等，质谱技术的出现为蛋白质分析提供了一种新的途径。现在蛋白质组学基本研究手段是：以生物质谱技术为，对蛋白质进行大规模、高通量分离、鉴定和分析。

蛋白质质谱鉴定的基本原理是用蛋白酶将蛋白质消化成肽段混合物，经MAILDI或ESI等软电离手段将其离子化，然后通过质量分析器将具有特定质核比的肽段离子分离开来。通过实际谱图和理论上蛋白质经过蛋白酶消化后产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行的比对，进行蛋白鉴定。

7.如何检测引物的纯度？

答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃，2mins)。加入尿素的目的一是变性，pcr实验室，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，实时荧光定量pcr，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。

而有的厂家提供Maldi-TOF质谱QC质量控制，从而保障了合成的准确率：

Bioneer使用多重Maldi-TOF质谱仪进行全自动装载及监测。 每份样品的质谱分析数据将自动插入到寡核苷酸的信息单中。Bioneer是世界上仅有的几个对生产的每份核苷酸 (单个寡核苷酸和高通量和成) 都用MALDI-TOF质谱仪检测进行核苷酸QC检测的厂商，而且免费提供质谱数据。

8.如何计算引物的浓度？

答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。

注意：1 OD260= 33 ug/ml.