16.长链引物为什么出错的几率非常高?
答:引物合成时,每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长,突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失,这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增,实时荧光定量pcr,不可能保证扩增产物中没有突变,引物合成也不可能保证100%正确。要知道,引物合成中发生错误(非人为因素)的频率,比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成,长链引物合成,您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
17.如果测序发现突变,该如何处理?
答:遇到这种情况,首先和核酸合成厂家取得联系,生产人员会检查生产的原始记录,主要是核对合成序列是否和定单一致,他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下,建议重新挑取测序,可能会找到正确的。根据经验,40个碱基以下的引物,测1-2个就可以了;40个以上的特别是用于全片段拼接合成的,就需要多测一些了。一般情况下,每个突变的位点都不一样,提示正确的总是有的,就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次,不过重合的引物和次的引物一样,都可能含突变,咸阳pcr,不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。***拼接过程中,如果发现一段区域突变点不多,就多测几个,否则就重合一下引物。
RNA提取处理的步骤如下:
在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%(DEPC-H2O)。(DEPC二焦碳酸酯为活性很强的物,须在通风橱中小心使用)
将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,pcr检测,注入DEPC-H2O,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中,在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。
将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中,将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口,高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。
灭菌塑料制品烘烤干燥,置洁净处备用。
玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。
1、细胞准备:细胞传到后,pcr引物设计,密度达到70%左右时进行转染;
2、细胞转染:取两个EP管,一个加入Opti-MEM、质粒和包装质粒;另一个加入Opti-MEM、lipo2000,然后将两管混匀;
3、细胞孵育:将混合液逐滴加入细胞培养皿中,混匀后孵育;
4、收集病毒:转染后48h、72h收集含慢病毒的上清;
5、滴度检测:细胞为30%-50%时加入病毒上清液,检测阳性细胞比例。
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