全转录组测序
全转录组是指特定***或细胞在特定状态下所有转录产物的总和，包括mRNA和各种noncoding RNA。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络，如果只是对某个单一RNA分子的研究，有时并不能准确的发现分子作用机制。而竞争性内源RNA(ceRNA)理论阐述了一种全新的转录调控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假***等）分子能够通过miRNA应答元件（microRNA Respe Element， MRE）竞争性地结合相同的miRNA来调节彼此的表达水平。举个例子：miRNA会导致***沉默现象发生，而如果lncRNA竞争性结合了miRNA，从而影响了miRNA***沉默功能实现。
ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一，通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。目前对全转录组简便的方法就是构建2个测序文库分别进行测序。标准的生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究内容，靶向调控网络、ceRNA网络、共表达网络分析可以将这几种RNA联合起来分析，从而发现新的调控网络模型。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了***all RNA的信息，所以需要另外再构建一个***all RNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他***all RNA的鉴定及注释信息。全转录组测序方案路线图如下所示：
microRNA芯片:
RNA干扰(RNA Interference， RNAi)现象是一种进化上保守的抵御或外来病毒qin犯的防御机制。将含有靶***mRNA同源互补序列的RNA（Double strand RNA， dsRNA）导入细胞后，能够特异地识别该mRNA，引起mRNA的降解，从而导致相应的功能缺失。RNAi提供了一种经济、快捷、gao效的***特异***表达的技术手段，该技术已被广泛用于研究***功能和chuan染性***及恶xingzhong瘤***zhi疗领域。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、 shRNA和siRNA等。
MiRNA是一类可以通过RNAi机制调节***表达的内源性小RNA，人工miRNA与shRNA的设计原理基本相同，pcr引物设计，由于miRNA具有内源性，因此其更易产生有效的***沉默。
技术流程：
dsRNA或pre-miRNA被导入细胞后，能够被一种特异的核酸内切酶（Dicer）识别并切割成为小片段，这些片段在RNA解旋酶的作用下解链。继之反义链在与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-Induced Silencing Complex，RISC），泰州pcr，RISC与mRNA同源区进行特异性结合，若miRNA与mRNA的结合位点配对，则切割mRNA；若miRNA与mRNA的结合位点不配对，则***mRNA的翻译。
16.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入、缺失、置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
17.如果测序发现突变，该如何处理？
答：遇到这种情况，荧光定量pcr，首先和核酸合成厂家取得联系，生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，他们在电脑中一般会保留所有原始数据。在确认引物合成序列没有输错的情况下，建议重新挑取测序，可能会找到正确的。根据经验，40个碱基以下的引物，测1-2个就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。也可以要求公司将引物免费重合一次，***检测怎么做，不过重合的引物和次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。***拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
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