步骤：(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、，逐滴加入二亚砜 (DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。(3)离心收集培养之细胞，用加的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0. 1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。(4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，胚胎冷冻仪，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO***后浓度为5～10%)，使细胞浓度为1～5×106cells/ ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。
慢速降温保存通常采用“两步法”，即步先将生物样品采用某个较慢的降温速率降温到 -80℃并维持一段时间，然后第二步再将己经处于 -80℃状态的生物样品直接投入液氮罐里（ -196℃）进行深低温的长期保存。慢速降温法的实质是使用较慢的降温速率，使得降温过程中细胞内的水逐渐脱离细胞，以达到减少细胞内冰晶形成的概率的目的，从而提高细胞的存活率。他的优势是所用的冷冻保护剂浓度较低，只需要3%-20%左右，但容易造成冷损伤和渗透压失衡。
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