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假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗1体夹心法测抗原的另一注意点是类风1湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗1体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗1体夹心法检测的血1清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗1体和酶标抗1体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab")或Fab片段作酶结合物的***,酶联******盒厂家,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗1体夹心法ELISA***是否受RF的影响,已被列为这类***的一项考核指标(参见6.2)。
双抗1体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。
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3、 细胞培养上清
取细胞培养上清到离心管,1000×g离心20min,除去细胞碎片及杂质,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。
4、 细胞裂解液
1) 吸去培养板内的培养基,用胰酶消化细胞,加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。
2) 收集细胞悬液,1000×g离心10min,弃去培养基,用预冷的PBS润洗3次。
3) 加入适量的预冷PBS或细胞裂解液(临用前加入蛋白酶抑1制剂)重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。
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