反相色谱中样品的保留值主要由固定相比表面积、键合相种类和浓度决定，保留值通常随链长增长或键合相的疏水性增强而增大．对于非极性化合物通常遵循以下规则：(弱)非键合硅胶《基lt;C1(TMS)lt;C3lt;***lt;lt;C8≈C18(强)。溶质保留值与固定相表面积成正比，普通载体(80 A°)的比表面积约为250 m2/g，而300A°孔径载体的比表面积约为60 m2/g。当其他条件相同时，溶质在300A°孔径(低表面积)色谱柱上的保留值大约为80A°孔径色谱柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨柱有利于强亲水性样品洗脱。样品的保留值也可以通过改变流动相组成或溶剂强度来调整，溶剂强度取决于的性质和其在流动相中的浓度。在反相色谱中，采用高溶剂强度、低极性的流动相时可获得较低的保留值。固定相的不同也可以导致选择性发生变化，基柱、柱、C8柱、C18柱等的选择性有很大差异，一般应优先考虑C8柱、C18柱，然后是基柱，再次是柱。4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。据统计，近80%的有机物及无机物可以用液相色谱法进行分离．其中反相色谱中的C18柱是液相色谱中为常用的一类色谱柱。
LC-100液相色谱系统分析前准备： 1、流动相前处理：将流动相经过0.45um的微孔滤膜过滤后，倒入流动相瓶中，放入超声波清洗器内震荡排气20分钟左右。 2、流动相安装：将处理好的流动相放在储液托盘上，将对应通道的洗液管路分别放入流动相瓶中，盖好瓶盖并记好对应通道的流动相种类。 3、样品记录：将样品处理稀释后使用***1器过滤头过滤后装入1.5ml样品瓶中（大约三分之二），放入自动进样器的样品架上，并记录样品瓶位置以便设置批处理文件。 4、色谱柱安装：打开柱温箱门，将色谱柱的出口端安装在色谱柱夹具上，在色谱柱上连接配管，在色谱柱出口端连接检测器入口端的蓝色PEEK管。 5、检查清洗液：在RINSE通道内放置50%甲1醇：水溶液；不稳定原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有***，使得两者不能密封。含有两根管路的通道内放置10%异丙1醇：水溶液。
LC-100液相色谱系统分析前准备： 1、流动相前处理：将流动相经过0.45um的微孔滤膜过滤后，倒入流动相瓶中，放入超声波清洗器内震荡排气20分钟左右。 2、流动相安装：将处理好的流动相放在储液托盘上，将对应通道的洗液管路分别放入流动相瓶中，盖好瓶盖并记好对应通道的流动相种类。 3、样品记录：将样品处理稀释后使用***1器过滤头过滤后装入1.5ml样品瓶中（大约三分之二），放入自动进样器的样品架上，并记录样品瓶位置以便设置批处理文件。 4、色谱柱安装：打开柱温箱门，将色谱柱的出口端安装在色谱柱夹具上，在色谱柱上连接配管，在色谱柱出口端连接检测器入口端的蓝色PEEK管。 5、检查清洗液：在RINSE通道内放置50%甲1醇：水溶液；不稳定原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有***，使得两者不能密封。含有两根管路的通道内放置10%异丙1醇：水溶液。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8)，太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到后一个过滤的步骤。
正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高～中 中～低
流动相极性 低～中 中～高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出