反相色谱影响因素(1)柱长有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加．但是柱长增加并不能使蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率显著增加．它们在较短的柱子上往往也有很好的分离效果。(2)流动相的流速。有机小分子和肽类的分辨率对流动相流速非常敏感。而蛋白质和核酸等生物大分子的分辨率则不然。流速越小，柱子越长，色谱峰的宽度就越大，分辨率就越小。制备色谱上样过程中的流速对动态吸附容量影响很大。(3)温度。温度上升，流动相黏度下降，流动速度加快，且流动相与固定相之间的传质速度加快，使分辨率增加。同时，温度上升，分子热运动增加，疏水性作用减弱。升高温度要考虑目标物质的热稳定性。(4)流动相组成。流动相的极性越大，溶质的分配系数越大，洗脱时间越长。RPC多采用降低流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。水是极性强的溶剂，在反相色谱中常常和基础溶剂配合使用，向流动相中加入不同浓度的、可以与水混溶的有机溶1剂，以得到不同强度的流动相，这些有机溶1剂称为修饰剂。反相色谱中的有机溶1剂。此外，乙醇、四氢呋1喃、异丙1醇及二氧六环也常被用作修饰剂。这时先看普通流量能否冲走，如果冲不走，那办法就是拆柱，把检测器直接连接到输送泵的出口，加大几部流量冲洗，则肯定能冲走气泡。有机溶1剂梯度的大小也会影响分辨率，一般梯度越小，分辨率越大。
柱流失检测在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验（不进样）。一般是以10℃/min从50℃升至使用温度，达到使用温度后保持 10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。在空白试验的色谱图中，不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下，色谱柱的性能开始下降，基线的信号值会。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和 GC系统有污染。其他：色谱柱的保存用进样垫将色谱柱的两端封住，并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分，保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。注意：当空气中氢气的含量在4-10%时，就有的***。对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，换成冲洗，接着用 异（4 6）冲洗柱子，再用换成冲洗，然后用纯水冲洗，后冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。所以一定要保证实验室有良好的通风系统。
液相色谱仪的常规操作及维修： 1、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3、打开HPLC工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。 4、进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。 6、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7、设计走样方法。点击file，选取se-lectusersandmethods，可以选有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a、进样前的稳流，一般2-5分钟；采用的粒径通常为：25～40μm，40～63μm或63～200μm的球形固定相。b、基线归零；c、进样阀的loading-inject转换；d、走样时间，随不同的样品而不同。 8、进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击trun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9、关机时，先关计算机，再关液相色谱。
柱流失检测在色谱柱老化过程结束后，利用程序升温作一次空白试验（不进样）。一般是以10℃/min从50℃升至使用温度，达到使用温度后保持 10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。在空白试验的色谱图中，不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下，色谱柱的性能开始下降，基线的信号值会。另外，如果在很低的温度下，基线信号值明显的大于初始值，那么有可能是色谱柱和 GC系统有污染。其他：色谱柱的保存用进样垫将色谱柱的两端封住，并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分，保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。注意：当空气中氢气的含量在4-10%时，就有的***。对于第二种情况，由样品的沉积引起污染的C18柱，和纯水反向冲洗柱子，换成冲洗，接着用 异（4 6）冲洗柱子，再用换成冲洗，然后用纯水冲洗，后冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。所以一定要保证实验室有良好的通风系统。液相色谱仪的常规操作及维修： 1、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3、打开HPLC工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。 4、进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。 6、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7、设计走样方法。点击file，选取se-lectusersandmethods，可以选有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击newmethod。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a、进样前的稳流，一般2-5分钟；采用的粒径通常为：25～40μm，40～63μm或63～200μm的球形固定相。b、基线归零；c、进样阀的loading-inject转换；d、走样时间，随不同的样品而不同。 8、进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击trun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9、关机时，先关计算机，再关液相色谱。
注意事项： 1、流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2、柱子是非常脆弱的，做的方法，先不要让液体过柱子。 3、所有过柱子的液体均需严格的过滤。 4、压力不能太大，至好不要超过2000psi。
LC-100液相色谱系统可分为“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分。 LC-100液相色谱系统的技术动态： 液相色谱和质谱连接，可以增加额外的分析能力，能够准确鉴定和定量像细胞和***裂解液，血液，血浆，尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量化合物。LC-100液相色谱系统提供了一些独特的优势，包括： 1、快速分析和流转所需的少样品准备。 2、高灵敏度并结合可分析多个化合物能力，甚至可以跨越化合物的种类。 3、高度，高分辨率鉴定和量化目标分析物。将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中，正常情况下，我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。
