笃玛 7-O-甲基白杨素 介绍说明

7-O-甲基白杨素
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有***，***或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合***盒的检测范围。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记***工作液 100μl（取1μl生物素标记***加99μl生物素标记***稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记***工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转***）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。

7-O-甲基白杨素
注：
1. 用户在初次使用***盒时，应将各种***管离心数分钟，以便***集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何***，只是***后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者***，请于2-8℃保存。标准品、生物素标记***工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记***工作液或、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
7-O-甲基白杨素
常用标签包括有Flag、myc、HA、His、GST、GFP、MBP等。
Flag标签系统利用一个短的亲水性八氨基酸肽（DYKDDDDK）融合到目标蛋白；其纯化条件是非变性的，因此可以纯化所有有活性的融合蛋白。
His标签是由6个组氨酸（His-His-His-His-His-His）组成的短肽，专门设计用于重组蛋白的吸附纯化。由于分子量小，且较容易分离和纯化，是目前使用***广泛的一种。
GST标签体系具有蛋白表达率高，表达产物纯化方便，利于GST***制备的特点。GST融合蛋白在水溶液中可溶，可从***裂解液中提取，在不变性的条件下通过亲和层析得到。
GFP或其突变体EGFP等广泛用于***表达效率的检测，以及和目的蛋白融合表达用于检测目的蛋白的表达和分别。GFP***不经可以检测GFP或其适当的突变体，也可以检测和GFP或其适当的突变体融合表达蛋白的表达、细胞内***，以及纯化、定性或定量检测GFP融合表达蛋白等。
Myc标签（序列为：EQKLISEEDL）已成功应用于WB杂交技术、***沉淀IP和流式细胞术中。因此可用于检测重组蛋白在***、酵母、昆虫细胞和哺乳细胞中的表达情况。Myc重组蛋白质可通过偶联Myc标签***到活化的琼脂糖上而进行亲和纯化。但Myc重组蛋白的低pH洗脱条件往往会降低蛋白质的活力，因此Myc标签系统广泛应用于检测但很少用于纯化。
HA标签系统利用一个HA（influenza hemagglutintin epitope:YPYDVPDYA）短肽融合到目标蛋白。HA标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统已广泛应用于多种细胞类型，相应的HA标签***也被广泛运用。
MBP标签蛋白大小为40kDa，由大肠***K12的malE***编码。MBP可增加在***中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在***中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。可用MBP***或表达的目的蛋白特异性***检测MBP标签标记的重组蛋白。
其余标签***还有V5、GFP、RFP、β-Actin、β-Tubulin、GAPDH、ERK1、AU1、***i、B、CBP、DDDDK、E、E2、Glu-Glu、HAT、HP***、HSV、KT3、KLH、MAT、Protein A、S、S1、SNAP、SRT、NWSHPQFEK、SUMO、T7、Tag-100、TAP、Trx、Ty1、TF、Universal、VSV-G等，但应用相对较少。