




辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质,HRP广泛分布于植物界,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多个同功酶组成,Mr在40000左右,等电点7.2。溶于水,溶解度为5%(W/V),溶液呈棕红色,透明。酶催化的***适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的***铵溶液。HRP可溶于0.58饱和度以下的***铵溶液,而0.62饱和度以上则不溶。该酶***适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下,HRP几周内稳定,加热到63℃,在15min内稳定。氧化还原电势很低,pH6.08时,E 0 =-0.2070V,pH为7.71时,E′0 =-0.2787V。HRP的辅基和酶蛋白***1大吸收光谱分别为403nm和275nm,人elisa***盒价格,一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。
保温
在ELISA中一般有两次抗原抗1体反应,即加标本和加酶结合物后。抗原抗1体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation),有人称之为孵育。
ELISA属固相***测定,抗原、抗1体的结合只在固相表面上发生。以抗1体包被的夹心法为例,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有***贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗1体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗1体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
(2) 包被抗1体(或抗原)的选择:将抗1体(或抗原)吸附在固相载体表面时,要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0~9.6之间。吸附温度,时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18~24小时。蛋白质包被的***适浓度需进行滴定:即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg/ml等)进行包被后,在其它试验条件相同时,观察阳性标本的OD值。选择OD值***1大而蛋白量***少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1~10μg/ml。(3) 酶标记抗1体工作浓度的选择:首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定(见酶标记抗1体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗1体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
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