由于反应温度低（如4℃）而导致反应速率相当慢，使得肽缩合反应通常需要几天才能完全。 对于较长的N端保护的肽链，酯基的肼解一般比较困难，因此，使用正交的N保护肼衍生物是一种选择。在肼基的选择性脱除后，按倒接（backing-off）策略组合的肽片段可以用于叠氮缩合。
如前所述，虽然叠氮法一直被认为是消旋化倾向的缩合方法，但在反应中，过量的碱会诱发相当大的消旋。因此，在缩合反应期间要避免与碱接触，例如，氨基组分的铵盐应采用N，N－二或N－代替三乙胺来中和。
肽链上的自由氨基是常见的肽修饰位点，百意欣提供多种修饰方法，使肽链的设计多样化：
乙酰化(Acetylation)
甲酰化(Formylation)
生物素标记(Biotin)
脂肪酸修饰(Palm， Myr，Lauryl)
TFA、Bzo、Abz、ClAc、Suc修饰
Hynic
Lipoic
NOTA
肽链C端羧基也是常见的修饰位点：
C端酰胺化(Amidation)
C端酯化(Ester)
AMC
AFC
PNA
Luciferin
CMK
当应用酯（R1＝异丁基、等）时，游离的单碳酸不稳定，立即分解为二氧化碳和相应的醇。然而，对于亲核进攻的区域选择性，Thymopentin胸腺肽，也有一些相反的报道，产物为氨基甲酸酯和原来的N保护氨基酸组分。 为了形成混合酸酐，将N保护的氨基酸或肽分别溶于、四氢、二氧六环、乙酯，用等当量的三级碱（N－、N－、N－等）处理。然后，在－15℃－－5℃，剧烈搅拌的同时加入酯以形成不对称酸酐（活化）。经短时间活化后，加入亲核性氨基酸组分。如果作为铵盐使用（需要更多的碱），必须避免碱的过量使用。如果严格按照以上的反应条件，混合酸酐法很容易进行，是的缩合方法之一。
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