pcr检测-pcr-南京英瀚斯生物科技(查看)

RIP

技术概述

RIP是研究体内蛋白与RNA互作的重要技术。该技术先用甲醛等***交联细胞内的“蛋白-RNA”互作复合物，pcr检测，裂解细胞后，pcr，用靶蛋白特异的抗l体(或标签抗l体)做免l疫沉淀，获得“靶蛋白-RNA”互作复合物，去交联分离其中的RNA;针对预测的靶蛋白结合RNA的序列设计引物，

做qPCR实验，验证预测的RNA是否与靶蛋白有结合，或者将分离出来的RNA做高通量测序，筛选到可能与靶蛋白结合的RNA。

技术流程

细胞交联-→细胞裂解-→免l疫共沉淀→去交联→RNA分离→建库→高通量测序(或qPCR)。

5.长可以合成多长的引物？

答：引物越长，出现问题的概率就越大。有的公司合成过120base的引物，产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，实时定量pcr，的产量很低。

6.需要合成多少OD数？

答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做***拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全***构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长，fish检测， 全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。

分子实验介绍——荧光检测

细胞荧光染色是以荧光物质标记而进行抗原***的技术。在细胞中，通过特定的标记，可以检测目的蛋白表达量和表达***。是细胞中的可直观观察细胞内蛋白***和表达的实验方法。

实验流程：细胞固定-细胞膜破膜-蛋白封闭-目的蛋白结合-荧光二抗结合-DAPI染色-荧光显微镜拍照或激光共聚焦显微镜拍照。

结果示例：

细胞荧光染

通过观察细胞中蛋白的荧光强度和***分析该蛋白的表达变化。