蛋白质的分离纯化在生***学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，实时定量pcr，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。
一、主要方法
1. 蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒不同程度的颗粒吸附力来使分离的目的达到）。
2. 按照配体特性的分离-亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异结合这一生物性质）。
3. 低温沉淀法，使用如，乙醇等与水可混溶的，降低多数蛋白质的溶解度并且将其析出，和盐析相比较，这种方法的分辨率更加的高，然而蛋白质比较容易变形，需要在低温下进行。
4. 按照分子大小不一样的方法，密度梯度离心（在介质中对蛋白质离心时，蛋白质沉降速度取决于它的质量和密度，质量和密度越大，那么沉降越快；凝胶过滤（一种柱层析）；超过滤（利用蛋白质分子不能从半透膜通过的性质）。
5. 按照溶解度差异分离，等电点沉淀法盐溶与盐析（使用一定浓度盐溶液来使蛋白质的溶解度增大或减小）；（因为在等电点时蛋白质分子的净电荷为 0，使分子间静电斥力减少了，所以，聚集沉淀比较容易，这时具有小的溶解度）。
6. 按照电荷不同的分离方法。主要分为离子交换层析和电泳分离。
9.如何计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：
Tm = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) - 600/size
公式中，Size = 引物长度。
Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents， like formamide or urea， Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati f***or hybrid formation， which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.
分子实验介绍——荧光定量PCR检测
荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。Sybr green在低样本量时成本较低，pcr检测，目前选用的较多。
SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，PCR实验室，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，pcr，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
实验流程：细胞或***RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。
结果示例：
图 A ***扩增曲线图；B ***扩增溶解曲线图；C mRNA相对表达量变化
从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。
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