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细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期：

细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，细胞实验外包公司，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，细胞实验外包，从而计算出各个期的百分含量。

一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。

一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。

结果示例：

                                   图 A 细胞周期检测图；B 细胞凋亡检测图

软gu细胞培养

(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。

(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节(保留周围肌肉，软gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软***，打开髋、膝关节，细胞实验外包哪家好，用尖刀削取关节软gu***，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软gu***被风干。

(3)PBS缓冲液充分漂洗软gu小块3次，然后用小剪刀将软gu块切碎至约Imm3大小。

(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，内江细胞实验，将细小的软gu块置入放有0.2%的II型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37°C恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软gu细胞混悬液。

(5)把消化所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37°C、5%CO2。

(6)未消化完的软gu小块继续用II型胶原酶如_上法消化，直至软gu块基本消失。

(7)每日在倒置显微镜下观察软gu细胞生长情况并拍照保存。

细胞传代培养

操作步骤

1.将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10m培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细zhen孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1- -3分钟。

4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37°C下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。

附:消化液配制方法:

称取0.25克胰酶蛋白酶(活力为1 : 250)， 加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank"s液溶解，滤器过滤chu菌，4°C保存，用前可在379C下回温。胰酶溶液中也可加入EDTA，使***终浓度达0.02%。