进口MILENIA02公司-立博泰业公司

RPA技术的基本原理

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，反应温度在37°C左右。

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物***了同源序列，进口MILENIA02公司，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。RPA扩增的基础体系(TwistAmp? Basic)含有DNA扩增所需的所有***，我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测，产物纯化后可用于下游研究。

在这个基础体系中添入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA应用。举例来说，TwistAmp? exo结合了的exo探针技术和核酸外切酶III，能实现数据的实时读取，进口MILENIA02公司，就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少，适合获得强荧光信号进行动力学分析，不适合终点检测(比如跑胶)。将exo探针技术、核酸外切酶III和逆转录酶结合起来，MILENIA02公司，可以一步实现RNA模板的实时扩增。

RPA技术

01  特别快，传统PCR要45分钟，因为要反复升温降温。RPA由于是恒温，所以只需要3-10分钟。

02  灵敏度高，因为是高度定向扩增，所以样品即便有点儿杂质也OK，免除了前处理环节，尽量多的保留了样本。

03  温度控制要求低，一般是加热到40℃，但是在紧急情况下，贴在人身上用***的体温36℃、37℃也没问题。甚至在室温25℃，也是可以运行，就是慢点儿，要等一个小时而已。

04  适用性强，面对RNA病毒，直接在***里加入逆转录酶就好，一锅端。

如何提高扩增曲线的可重复性?

A 优化扩增曲线考虑以下因素: 对于低拷贝数模板，不稳定扩增可能是因为达到检测限或者是反应混匀程度不同（未混匀的反应扩增效率不佳）。另外，在低温情况下存贮，重组酶和辅助蛋白在50%甘油情况下形成沉淀，也是可能导致不稳定扩增的原因。所以，20x主要反应mix在室温下解冻并震荡涡旋将使其成为液体，不影响其功能，并且有效提高扩增效率。不稳定扩增也可能是因为master mix量不足，在加入体系前，用户必须保证震荡后20x主要反应组分均一。