南京分子生物-英瀚斯-分子生物仪器

RNA提取

1.弃去培养液，用PBS清洗两次1-2。

2.弃去PBS，用1000u1枪吸干净残余PBS。

3.加1ml TRIZOL研磨B 41。

4. 1.5mIEP管标号与每孔相对应备用。

5.研磨好的溶液转移至对应的 EP管中国。

6.往每个EP管中加入250ul，南京分子生物，剧烈震荡30s， 冰上静置12min[问l。

7. 所有样品4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 15min.

8. 再次标记一批同样编号EP管。

9.离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充

分混匀。4C冰箱35min。

10. 4C离心，转速: 13500转1分钟，时间: 10min.

11.弃去.上清液，加1m175%乙醇，轻摇7]。

12. 4C离心，10600转/分钟，时间: 5min.

13. 弃上清液滤纸吸干。

14. 加DEPC水10ul溶解，-80C保存。进行逆转录前测浓度。

***RNA提取

1、剪米粒大小***块放入EP管中标号。

2、EP管中加300ul trizol浸泡30分钟或更久。

3、用研磨棒研磨，以肉眼很难看到***为宜。

4、加700u1 trizol静 置5分钟。

miRNA测序

microRNA(miRNA)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶***mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或***mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（新发现miRNA也能在转录水平调控***表达）。miRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和***等中发现的miRNA表达均有严格的***特异性和时序性。miRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技术以及第二代测序技术。基于第二代测序技术的miRNA测序，可以一次获得数百万条miRNA序列，能够快速鉴定出不同***、不同发育阶段、不同***状态下已知和未知的miRNA及其表达差异，为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

动物***细胞***组DNA提取

操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物***块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，分子生物学应用，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见***块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另

一离心管中。

2.加2倍体积异，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

3.加等量的酚??振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

4.取上层溶液至另一管，分子生物仪器，加入等体积的?，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

5. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ，10min。

6.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，常用的分子生物学技术，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。